《Bioact. Mater.》：支架孔隙形态调节骨再生机制

骨仿生学和结构工程激发了人们对优化人工支架以实现更好的骨再生的广泛兴趣。然而，支架孔隙形态调节骨再生背后的机制尚不清楚，这使得用于骨修复的支架结构设计具有挑战性。为了解决这个问题，来自华南理工大学的况宇迪、赵娜如、王迎军等人仔细评估了三种代表性孔隙形态（即圆柱形（C）、螺旋形（G）和菱形（D））β-TCP支架的成骨性能（图1a）。结果表明 D 型支架通过增强 RhoA/ROCK2 通路的机械信号转导促进 BM

SC 向成骨分化并分泌更多与迁移相关的生长因子，从而在这些支架中实现最佳骨再生（图1b）。这项工作为开发新型生物适应性支架设计提供了对孔隙形态介导的骨再生机制的见解。相关研究成果以“3D printed pore morphology mediates bone marrow stem cell behaviors via RhoA/ROCK2 signaling pathway for accelerating bone regeneration"为题于2023年3月20日发表在《Bioact. Mater.》上。

图1 不同孔隙形态的支架方案及支架-BMSC相互作用机制：（A）具有圆柱形、螺旋形和菱形孔形态的 3D 打印支架；（B）孔隙形态介导的细胞骨架力和 BMSCs 的核变形通过 RhoA/ROCK2 信号通路促进骨再生

1. 不同孔形态的β-TCP支架上的骨髓间充质干细胞行为

成功制备了三种孔结构的β-TCP支架（图2a），BMSCs在支架上表现出不同的铺展状态(图2b)。由于细胞的不同伸展和伸长状态会影响基因的表达，这些支架上的BMSCs可能会表现出不同的细胞行为和命运。随后制备了一种定制的具有整合路径的支架（每个路径由一种孔形态组成）评估BMSCs从支架外到支架内部的迁移行为，如图2C所示。迁移实验表明，D-和G-支架具有更好的引导骨再生的潜力（图2D，E）。CCK8检测结果显示，BMSCs在C-支架上的增殖情况明显好于其他各组(图2F)，这可能归因于类多边形展开态引起的内应力的松弛碱性磷酸酶（ALP）活性（图2G）和RT-qPCR（图2H）结果显示，第7天，D支架组ALP、Col-1、OCN和Runx2的表达最高，C支架组最。低。上述结果证实了D-支架在这些支架中诱导BMSCs成骨分化效。果。最。好。此外，研究了孔形态对BMSCs血管生成因子旁分泌的影响（图2I）)。成血管测试表明G-支架组BMSC培养上清液中VEGF和Ang-1的浓度最高（图2J），具有更好的骨再生效果（图2K,L）。

图2 骨髓间充质干细胞在不同β-tCP支架上的细胞行为

2. 孔形态介导的骨髓间充质干细胞行为的信号转导机制

RNA测序结果显示，与C组相比，D组和G组的一些基因表达上调（图3A），表明骨髓间充质干细胞在D-支架中的迁移能力最。强。此外，与C-支架组相比，G-和D-支架组中成骨分化相关基因(例如OCN3、BMP2和ALPK1)和血管生成相关因子(例如VEGFA、PDGFC和PDGFA)也上调(图3B，C)。聚类分析和热图的树状图显示，RhoA/ROCK2信号通路相关基因(DVL2、DAAM1、RhoA和ROCK2)在G-和D-支架组的表达高于C-支架组(图3D)。RT-qPCR分析和Western blotting也证实了RhoA/ROCK2信号通路相关基因和蛋白在G-支架和D-支架中的高表达(图3E-L)。这些结果揭示了BMSCs在不同孔形态的支架中进行不同的细胞骨架重组和机械应力传递。

图3 RNA测序和生物信息学分析

随后，检测了在不同支架上培养的BMSCs在含有和不含RhoA/ROCK2抑制剂的培养液中的成骨分化和迁移因子水平。当细胞培养液中没有RhoA/ROCK2抑制剂时，G-和D-支架组比C-支架组RhoA、ROCK2和激活蛋白(p-RhoA、p-ROCK2)水平更高(图4A-D)。CDC42、OCN和Runx2的蛋白表达水平顺序为D-支架>G-支架>C-支架。这些结果表明，RhoA/ROCK2信号通路在转导支架孔形态刺激调控BMSCs成骨分化和迁移中发挥了重要作用。图4E是支架孔形态介导的BMSC行为机理图，孔形态通过RhoA/ROCK2信号通路影响BMSCs成骨分化和迁移。

图4 (A-C)药物对RhoA/ROCK2信号通路的干预；(D)用ELISA法检测在RhoA和RoCK2抑制剂干预前后7天不同孔隙形态的成骨相关Runx2和迁移相关CDC42蛋白的水平；(E)机制综述：孔形态通过RhoA/ROCK2信号通路影响BMSCs成骨分化和迁移

3. 不同孔形态支架体内骨再生的评价

随后，构建股骨髁缺损评价支架体内骨再生效果（图5A）。骨小梁计数、Micro-CT、血管分布检测、Van Gieson染色(VG)结果均显示G-和D-支架的血管生成能力强于C-支架，可以促进骨再生。

图5 股骨髁缺损区术后4周、8周、12周植入支架的组织学分析及Micro-CT检查

此外，通过连续荧光标记检测所有支架在2-4周和6-8周的动态成骨来评估骨再生率(图6)。柱状缺损区被分为三个部分(外层：0-1 mm，中层：1-2 mm，内层：2-3 mm)，以更好地定量缺损区不同区域的新骨生长(图6a)。荧光标记染色结果显示，C-支架组支架的新骨沉积速度从外到中逐渐减慢，C-支架中心区域几乎没有新骨(图6B，C)。相比之下，D和G支架的中层和中心层的骨沉积速率明显较高，表明细胞在支架中的迁移速率不同。这些结果揭示了支架形态对体内新骨生长的重要指导作用。

图6 成骨的动态组织学分析

综上所述，本文在体外和体内评估了三种孔结构的β-TcP支架的成骨潜力。D-支架通过影响BMSCs的黏附状态，激活较高水平的RhoA/ROCK2信号转导通路，促进细胞迁移，促进BMSCs的成骨分化。同时，D-支架和G-支架还可通过影响骨髓间充质干细胞的旁分泌来促进血管生成。在体内骨修复的评价中，D-支架在促进骨修复方面的表现优于G-支架和C-支架。这项工作加深了我们对孔形态影响细胞行为的机制的理解。