武汉大学黎威教授课题组：具有长效抗菌效果的活性益生菌微针贴片

伤口感染是指伤口在愈合过程中仍被细菌或其他微生物感染的疾病。与急性伤口不同，慢性感染性伤口通常经历较长时间的愈合过程或无法愈合，给患者带来了严重的后果和沉重的负担。传统上，感染伤口的治疗方法主要包括定期伤口清创、口服抗生素、抗菌敷料等。但是这些方法都有一定的局限，首先，细菌在伤口部位产生的生物膜形成物理屏障，限制抗菌剂或生物大分子渗透到深部组织，从而显著降低药物递送效率；其次，抗生素的误用和过度使用是增加抗生素耐药性风险的主要驱动因素，抗生素耐药性已成为严重的全球健康问题；此外，频繁更换敷料，可能会导致伤口疼痛和继发性损伤，从而显著降低患者的依从性。因此，非常需要研发一种新的伤口愈合治疗策略。

基于此，武汉大学药学院黎威教授团队设计开发了一种具有长效抗菌效果的活性益生菌微针贴片，用于治疗慢性感染伤口。该微针贴片是利用摩方精密 microArch® S240 （精度：10μm）3D打印设备加工模具后经PDMS翻模制备而成，相关研究成果以“Accelerated infected wound healing by probiotic-based living microneedles with long-acting antibacterial effect"为题发表在期刊《Bioactive Materials》上。武汉大学药学院硕士研究生靳银丽、武汉大学中南医院药剂科卢云、武汉大学药学院博士研究生江雪为共同第一作者，武汉大学药学院黎威教授、武汉大学中南医院整形美容科郭亮主任医师为共同通讯作者。

该微针贴片（5% GL MN）由聚乙烯醇（PVA）、蔗糖、5%甘油和罗伊氏乳杆菌制成。其中，PVA-蔗糖基质为5% GL MN提供足够的机械强度，促进5% GL MN在插入皮肤后快速溶解，从而实现罗伊氏乳杆菌的快速递送；罗伊氏乳杆菌可以代谢甘油产生具有抗菌作用的罗氏菌素，从而在慢性感染伤口处实现抗菌、减少炎症、促进伤口愈合的作用。值得注意的是，在5% GL MN中加入的甘油不仅不影响罗伊氏乳杆菌的存活，而且还为罗伊氏乳杆菌持续产生罗氏菌素提供了充分来源，从而在伤口深处实现长效抗菌和抗炎作用。

图1.用于慢性感染伤口愈合的5% GL MN示意图。（a）含有罗伊氏乳杆菌的5% GL MN示意图。（b）罗伊氏乳杆菌具有抗菌和抗炎作用的工作机理。（c）5% GL MN具有长效抗菌作用，可加速感染伤口愈合。

首先采用真空辅助微成型方法制备GL MNs 贴片，并对微针的形貌、机械强度、穿刺皮肤的能力、溶解速度以及释药效率等进行一系列表征。

图2. GL MNs贴片的制造和表征。（a）GL MNs贴片的制作过程示意图。（b）具有不同甘油浓度的GL MNs 贴片的代表性明场显微镜图像。（c）分别含有0%、2.5 %和5 %甘油的GL MNs 贴片的力-位移曲线。（d）GL MNs 贴片插入猪皮肤后的代表性明场和荧光显微镜图像。（e）施用GL MNs贴片后猪皮肤的组织学切片图像。（f）GL MNs贴片施用于猪皮肤后不同时间的代表性明场显微镜图像。（g）施用于猪皮后残留微针长度的定量分析。（h）GL MNs 贴片在PBS中的累积药物释放。每个点代表平均值±SD（n = 3），***P < 0.001。

制备的GL MNs 贴片结构为基底半径200 μm，高度850 μm，尖部半径∼10 μm的锥形，微针排列成10×10阵列，面积为7 mm×7 mm。罗伊氏乳杆菌以良好的形态封装在微针内。液相色谱-质谱联用（LC-MS）结果显示，罗伊氏乳杆菌产生的物质中存在与3-羟基丙醛（3-HPA）相对应的分子离子峰（M=74.0607），这表明罗伊氏乳杆菌具有产生抗菌物质罗氏菌素的能力。定量分析表明，5 % GL MNs 中的罗伊氏乳杆菌能产生更多的罗氏菌素。而罗氏菌素可以引起大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌的显著形态变化，据推测，罗氏菌素通过抑制细菌核糖核苷酸还原酶的活性，而核糖核苷酸还原酶对DNA合成至关重要，从而实现广谱抗菌活性。

图3. 5% GL MN 贴片的表征和罗氏菌素的抗菌作用。（a）5% GL MN 贴片（b）5% GL MN贴片单根针的横截面和（c）从5% GL MN 贴片中提取的罗伊氏乳杆菌的FESEM图像，（b）中的黄色箭头表示微针中存在罗伊氏乳杆菌。（d）对5% GL MN 贴片中罗伊氏乳杆菌产生的罗氏菌素的LC-MS分析。（e）含有不同浓度甘油的GL MNs贴片产生罗氏菌素的定量分析。（f）大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌用罗氏菌素治疗后形态的代表性FESEM图像。每个点表示平均值± SD（n = 3），*P < 0.05，***P < 0.001。

随后，为了进一步评估5% GL MN贴片的抗菌效果，通过细菌的活死染色实验、平板涂布和抑菌圈实验来验证5% GL MN贴片具有良好的抗菌效果。此外，5 % GL MN贴片在体外也显示出有效的金黄色葡萄球菌生物膜清除率，这通常在有害细菌的耐药性中起关键作用。

图4. 5% GL MN贴片在体外的抗菌作用。（a）金黄色葡萄球菌与GL MNs贴片孵育24小时后的活/死测定。（b）GL MNs贴片处理后大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌的细菌死亡率。（c） LB琼脂平板的代表性明场图像，显示大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌在与不同GL MNs贴片孵育24小时后的生长情况。（d）接受不同GL MNs贴片处理24小时后LB液体培养基中大肠杆菌，金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞杆菌的OD600值。（e）不同GL MNs贴片处理24小时对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞杆菌抑制区的代表性明场图像。红色虚线圆圈表示对药敏片的位置，黑色虚线圆圈表示抑制区。（f）对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞杆菌的抑制区的直径。每个点代表平均值±SD（n = 3），***P < 0.001。ns 表示无显著性差异。

图5. 5% GL MN贴片体外的生物膜清除效果。（a）金黄色葡萄球菌接受不同治疗后的共聚焦激光扫描显微镜图像。绿色：活细菌。（b）不同微针处理后用结晶紫染色的生物膜图像。（c）金黄色葡萄球菌在（a）中接受不同处理后的生物膜清除率。（d）金黄色葡萄球菌在（b）中用不同微针处理后的生物膜清除率。每个点表示的平均值±SD（n = 3）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。ns 表示无显著性差异。

紧接着，通过流式细胞术、实时定量聚合酶链反应（qPCR）、蛋白质印迹（WB）验证了基于罗伊氏乳杆菌GL MNs贴片的抗炎作用。

图6. 体外GL MNs贴片的抗炎特性。（a）流式细胞术分析不同组的RAW 264.7的细胞内CD86的荧光强度。（b）不同组的流式细胞术直方图。（c）不同组的CD86相对表达水平。（d-e）不同处理后通过qPCR测定RAW 264.7细胞中IL-6和TNF-α的表达水平。（f-h）不同处理后通过蛋白质印迹法测定RAW 264.7细胞中IL-6和TNF-α的表达水平。每个点表示平均值±SD（n = 3），*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

基于GL MNs贴片的形态、皮肤穿透能力、机械强度、溶解速度和抗菌功效等方面的表征，确定5 % GL MN是递送罗伊氏乳杆菌到伤口处进行抗菌的最佳方案。之后，细胞活死染色实验及细胞溶血实验证明了5% GL MN贴片在体外具有优异的生物相容性。罗伊氏乳杆菌在5% GL MN贴片中的稳定性对于维持其抗菌活性至关重要，将5% GL MN贴片在4℃和25℃下分别保存，罗伊氏乳杆菌在室温下可在5% GL MN贴片中存活7天，超过40%的活菌保留在贴片中；将贴片置于4℃时，罗伊氏乳杆菌在60天后仍保持高活力（>80%），这表明罗伊氏乳杆菌在5% GL MN贴片中具有长期稳定性。

图7. 5% GL MN贴片的细胞毒性和稳定性。（a）接受不同处理后NIH-3T3细胞的活/死测定。（b） 接受不同处理后 NIH-3T3 细胞和 HUVEC 细胞的活力分析。MRS琼脂平板的明场图像显示0%和5% GL MN贴片中罗伊氏乳杆菌在25℃（c）或4℃（e）下储存时细菌活力随时间变化情况。在25℃（d）或4℃（f）下储存不同时间后，0%和5% GL MN贴片中罗伊氏乳杆菌的菌落计数。每个点表示平均值±SD（n = 3）。

然后，在小鼠身上建立全层皮肤伤口模型，将5% GL MN贴片施用于伤口处，可以看到5% GL MN贴片可以促进伤口的愈合，并且对伤口处的金黄色葡萄球菌有持续的抑制作用。

图8. 5% GL MN贴片在体内的抗菌作用。（a）体内实验的时间方案。（b）小鼠接受不同治疗后第0、3、5、7、9天皮肤伤口的代表性图片。黑色虚线圆圈表示原始伤口区域（直径：1厘米）。（c）9天内不同组的伤口形态变化示意图。（d）不同组在第 0、3、5、7和9天从伤口组织中分离出的金黄色葡萄球菌菌落的代表性图像。（e）不同处理的小鼠皮肤伤口剩余面积比例-时间曲线。（f）不同组在第 0、3、5、7 和9天从伤口组织中分离的金黄色葡萄球菌菌落计数。（g）小鼠接受不同治疗后的体重变化。每个点表示平均值±SD（n = 7），*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。ns表示无显著性差异。

最后，对小鼠伤口处皮肤进行病理学切片染色，H&E、Masson、IL-6、CD31染色表明，5% GL MN贴片具有良好的促进伤口愈合、减少炎症反应、促进血管生成的作用。

图9. 不同治疗后的组织再生、炎症反应和血管生成。第9天不同处理后（a）H&E染色（b）Masson染色和（c）IL-6免疫组化染色的代表性明场显微图像。（a）中的蓝色箭头表示伤口长度，黑色箭头表示伤口厚度。（d）在第9天不同治疗后用CD31（红色）和DAPI（蓝色）染色后伤口组织新生血管形成的免疫荧光图像。第9天不同治疗组的H&E染色显示的伤口长度（e）和伤口厚度（f）分析。（g）第9天不同治疗组的胶原蛋白体积分数（CVF）。（h）在第9天不同治疗组IL-6的阳性细胞数。（i）第9天不同治疗的CD31阳性细胞数。每个点表示平均值±SD（n = 7），*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

结论：综上，研究团队开发了一种新型且生物相容性良好的益生菌微针贴片，具有长效抗菌作用，可促进感染伤口的愈合。微针贴片为益生菌提供了良好的保护，在4℃下，它在微针贴片内保持高达80%的活力超过60天。插入皮肤后，微针贴片迅速溶解并实现益生菌在深层伤口组织中的快速递送，益生菌能够在伤口中存活约一周，并不断将共同递送的甘油转化为抗菌物质，从而在感染的伤口中实现长效抗菌作用。在金黄色葡萄球菌感染伤口的小鼠模型中，与对照组相比，一次施用益生菌微针贴剂在消除有害细菌和促进伤口闭合方面表现出更好的效果，同时减少炎症、增强组织再生和血管生成，这对慢性感染伤口的治疗具有巨大潜力。